陽離子脂質材料DOTMA、DOPE脂質體轉染實驗步驟
更新時間：2021-05-25 點擊次數(shù)：993次
脂質體(LR)試劑是陽離子脂質體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下最方面的轉染方法之轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需要優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數(shù)繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間，因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24h為宜。
細胞種類：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
一、操作步驟：
取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養(yǎng)基，37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時。
2)轉染液制備：在聚苯y(tǒng)i烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉染
3)轉染準備：用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養(yǎng)基
4)轉染：把AB復合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
5)其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同
6)注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。
二、脂質體快速轉染法的操作步驟
1)將5 105個細胞/孔接種到6孔板中培養(yǎng)24h，使細胞達到50%-60%的板底面積。
2)在試管中制備DNA-脂質體復合物
1.1)在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-新質粒DNA或供體DNA
1.2)旋轉1s，然后加入脂質體混懸液，旋轉。
1.3)室溫放置5-10分鐘，使DNA與脂質體結合。
3.棄去細胞內的舊液，用1m1無血清DMEM洗滌細胞一次，然后棄去細胞，直接向每個孔中加入1 m1脫氧核糖核酸-脂質體復合物，在37培養(yǎng)3-5天，然后向每個孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14-24小時。吸出脫氧核糖核酸脂質體混合物，加入含10%胎牛血清的新鮮DMEM，2m1/l，培養(yǎng)24-48h。通過細胞刮取或消化收集細胞用于分析和鑒定.
三、穩(wěn)定的脂質體轉染方法：
1)接種的細胞與上述相同，細胞生長到50%
2)DNA-脂質體復合物轉染細胞的制備同上。
3)向每個孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM，在37培養(yǎng)48h。
4)吸出DEM，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞，讓細胞生長一定時間，篩選轉染克隆。該方法按照細胞克隆篩選方法進行。
